https://www.mdpi.com/2079-6382/7/4/89/htm
Identification of Essential Oils with Strong Activity against Stationary Phase Borrelia burgdorferi
Identification des huiles essentielles à forte activité contre la phase stationnaire Borrelia burgdorferi
Antibiotiques 2018 , 7 (4), 89; doi: 10.3390 / antibiotics7040089
Article
Identification des huiles essentielles à forte activité contre la phase stationnaire Borrelia burgdorferi
Jie Feng 1
, Wanliang Shi 1
Judith Miklossy 2
Geneviève M. Tauxe 1
Conor J. McMeniman 1
et Ying Zhang 1, *
1
Département de microbiologie moléculaire et d'immunologie, École de santé publique Bloomberg, Université Johns Hopkins, Baltimore, MD 21205, États-Unis
2
Centre international de recherche Alzheimer, Fondation pour la prévention Alzheimer internationale, Martigny-Croix CP 16 1921, Suisse
*
Auteur à qui la correspondance doit être adressée.
Reçu le: 28 août 2018 / accepté le 10 octobre 2018 / publié le 16 octobre 2018
Abstrait : La maladie de Lyme est la maladie à transmission vectorielle la plus répandue aux États-Unis. Alors que la majorité des patients atteints de la maladie de Lyme peuvent être guéris avec un traitement antibiotique de 2 à 4 semaines, environ 10 à 20% des patients continuent de souffrir de symptômes persistants. Bien que la cause de cette maladie ne soit pas claire, une infection persistante a été proposée. Il a été récemment démontré que B. burgdorferi développait des persistances dormantes dans des cultures en phase stationnaire qui ne sont pas tuées par les antibiotiques actuels de la maladie de Lyme, et il existe un intérêt pour l'identification de nouveaux médicaments candidats permettant de tuer plus efficacement de telles formes. Nous avions précédemment identifié certaines huiles essentielles hautement actives ayant une excellente activité contre le biofilm et la phase stationnaire B. burgdorferi. Ici, nous avons examiné 35 autres huiles essentielles et trouvé 10 huiles essentielles (bulbes d' Allium sativum L., baies de Pimenta officinalis Lindl., Graines de Cuminum cyminum L., Cymbopogon martini var. Motia Bruno grass, Commiphora myrrha (T. Nees) Engl. , Hedychium spicatum Buch.-Ham., Ex-Sm. Fleurs, Amyris balsamifera L., Thymus vulgaris L., Litsea cubeba (Lour.), Pers, Eucalyptus citriodora Hook.) Et le composant actif de l'écorce de cannelle, le cinnamaldehyde (écorce de cannelle). CA) à faible concentration de 0,1% ont une forte activité contre la phase stationnaire B. burgdorferi . À une concentration inférieure à 0,05%, les huiles essentielles des bulbes d’ Allium sativum L., de Pimenta officinalis Lindl. baies, Cymbopogon martini var. motia Bruno grass et CA ont encore montré une forte activité contre la phase stationnaire B. burgdorferi . L'AC a également montré une forte activité contre B. burgdorferi en cours de réplication, avec une CMI de 0,02% (ou 0,2 µg / mL). Dans les études sur la sous-culture, les cinq principales huiles essentielles touchent les bulbes de Allium sativum L., Pimenta officinalis Lindl. baies de Commiphora myrrha (T. Nees) Engl. résine, Hedychium spicatum Buch.-Ham. ex Sm. fleurs et Litsea cubeba (Lour.) Pers. les fruits ont complètement éradiqué toutes les cellules de la phase stationnaire de B. burgdorferi à 0,1%, tandis que Cymbopogon martini var. motia Bruno grass, Eucalyptus citriodora Hook. les feuilles, le bois d' Amyris balsamifera L., les graines de Cuminum cyminum L. et de Thymus vulgaris L. n'ont pas réussi à le faire, comme le montre la croissance spirochétale visible après une sous-culture de 21 jours. À une concentration de 0,05%, seules l'huile essentielle de bulbes d' Allium sativum L. et CA ont stérilisé la culture en phase stationnaire de B. burgdorferi , comme le montre l'absence de repousse pendant la sous-culture, tandis que Pimenta officinalis Lindl. baies de Commiphora myrrha (T. Nees) Engl. résine, Hedychium spicatum Buch.-Ham. ex Sm. fleurs et Litsea cubeba (Lour.) Pers. les huiles essentielles de fruits ont toutes eu une croissance visible pendant la sous-culture. Des études ultérieures sont nécessaires pour déterminer si ces huiles essentielles hautement actives pourraient éradiquer l'infection persistante à B. burgdorferi in vivo.
Mots clés:
Borrelia burgdorferi ; persiste; biofilm; activité anti-microbienne; huiles essentielles
1. Introduction
La maladie de Lyme, causée par le spirochète Borrelia burgdorferi, est la maladie à transmission vectorielle la plus répandue aux États-Unis, avec environ 300 000 cas par an [ 1 ]. Alors que la majorité des patients atteints de la maladie de Lyme peuvent être guéris avec l’antibiotique standard de 2 à 4 semaines avec la doxycycline, l’amoxicilline ou le céfuroxime [ 2 ], environ 36% des patients continuent de souffrir de symptômes persistants de fatigue, de douleurs articulaires ou musculo-squelettiques, et des symptômes neuropsychiatriques, même six mois après la prise de l’antibiothérapie standard [ 3 ]. Ces derniers patients souffrent d'une maladie mal comprise, appelée syndrome de maladie de Lyme post-traitement (PTLDS). Bien que la cause de PTLDS ne soit pas claire et soit probablement multifactorielle, les facteurs suivants peuvent être impliqués: auto-immunité [ 4 ], réponse de l'hôte aux débris morts de l'organisme de Borrelia [ 5 ], lésions tissulaires causées lors de l'infection et infection persistante. Divers rapports anecdotiques ont démontré la persistance de l'organisme malgré le traitement antibiotique standard [ 6 , 7 , 8 ]. Par exemple, la culture de bactéries B. burgdorferi chez des patients malgré le traitement a été rapportée comme des cas peu fréquents [ 9 ]. De plus, dans des études sur des animaux chez la souris, le chien et le singe, il a été démontré que le traitement antibiotique actuel de Lyme par la doxycycline, le céfuroxime ou la ceftriaxone ne permet pas d’éradiquer complètement l’organisme Borrelia , comme le détectent le xénodiagnostic et la PCR [ 6 , 7 , 8 , 10 ], mais les organismes viables ne peuvent pas être cultivés au sens classique du terme, contrairement à d'autres infections bactériennes persistantes, telles que la tuberculose après traitement [ 11 , 12 ].
Récemment, il a été démontré que B. burgdorferi peut former diverses persistes non en croissance dormantes dans des cultures en phase stationnaire tolérantes ou non tuées par les antibiotiques actuels utilisés pour traiter la maladie de Lyme [ 13 , 14 , 15 , 16 ]. Ainsi, alors que les antibiotiques actuels de Lyme sont efficaces pour tuer B. en croissance, Burgdorferi, ils ont une faible activité contre les bactéries persistantes enrichies en culture en phase stationnaire [ 14 , 16 , 17 ]. Par conséquent, il est intéressant d'identifier les médicaments plus actifs contre le B. burgdorferi que les antibiotiques actuels de la maladie de Lyme. Nous avons utilisé la culture en phase stationnaire de B. burgdorferi comme modèle persistant et avons effectué des criblages à haut débit et identifié une gamme de médicaments candidats tels que la daptomycine, la clofazimine, les sulfamides, la daunomycine, etc., qui ont une forte activité contre les persistant de B. burgdorferi . Ces médicaments actifs agissent différemment des antibiotiques actuels de la maladie de Lyme, car ils semblent cibler préférentiellement la membrane. Nous avons constaté que les formes persistantes variantes telles que les corps ronds, les microcolonies et les biofilms présentant un degré de persistance croissant in vitro, ne peuvent pas être tués par les antibiotiques actuels de Lyme ni même persister par des médicaments tels que la daptomycine seule, et qu'ils ne peuvent être tués que par une combinaison. des médicaments qui tuent les persistants et des médicaments qui tuent les formes en croissance [ 14 ]. Ces observations fournissent une explication possible à l'appui d'une infection persistante malgré un traitement antibiotique in vivo.
Bien que la daptomycine ait une bonne activité anti-persistance, elle est chère et constitue un médicament par voie intraveineuse, difficile à administrer et à adopter en milieu clinique et dont la pénétration est limitée à travers la barrière hémato-encéphalique. Il existe donc un intérêt pour l'identification de médicaments candidats alternatifs ayant une activité anti-persistance élevée. Nous avons récemment passé au crible un panel de 34 huiles essentielles et avons découvert que les trois principaux candidats, l'huile d'origan et ses composants actifs, le carvacrol, l'écorce de cannelle et le bourgeon de girofle, avaient une activité anti-persistance encore meilleure que celle de la daptomycine à 40 μM [ 18 ]. Pour identifier plus d'huiles essentielles ayant une forte activité contre B. burgdorferi persiste, dans cette étude, nous avons examiné 35 huiles essentielles différentes supplémentaires et avons trouvé 10 huiles essentielles (ail, piment de la Jamaïque, cumin, palmarosa, myrrhe, hydacheim, amyris, thym blanc, blanc). cubeba , eucalyptus citronné) et le composant actif de l’écorce de cannelle, le cinnamaldéhyde, ayant une forte activité dans la phase stationnaire du modèle B. burgdorferi persister.
2. Matériels et méthodes
2.1. Organisme et conditions de culture
La souche B. burgdorferi B31 5A19 à faible passage a été aimablement fournie par la Dre Monica Embers [ 15 ]. Tout d'abord, nous avons préparé la culture B. burgdorferi B31 en milieu BSK-H (HiMedia Laboratories, Mumbai, Inde), complétée par un sérum de lapin à 6% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) sans antibiotiques. Après une incubation de sept jours dans un incubateur microaérophile (33 ° C, 5% de CO2), la culture de B. burgdorferi est passée en phase stationnaire (~ 10 7 spirochètes / ml), suivie de l'évaluation de l'activité anti-persistant potentielle des huiles essentielles dans Plaque 96 puits (voir ci-dessous).
2.2. Huiles Essentielles et Drogues
Nous avons acheté un panel d’huiles essentielles (Plant Guru, Plainfield, NJ, États-Unis) et de cinnamaldéhyde (CA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis). Les huiles essentielles de la société Plant Guru sont testées par un laboratoire tiers à l'aide de la méthode GC / MS, et le rapport GC / MS est disponible sur leur site web [ 19 ]. Des huiles essentielles solubles dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été préparées à 10% ( v / v ) dans du DMSO sous forme de solution mère, qui a ensuite été ajoutée avec des cultures en phase stationnaire âgées de sept jours à raison de 1:50 pour obtenir 0,2% d'huiles essentielles. dans le mélange. Les huiles essentielles à 0,2% ont ensuite été diluées dans la culture en phase stationnaire afin d'obtenir la concentration souhaitée pour évaluer l'activité anti-borrélienne. Des huiles essentielles insolubles dans le DMSO ont été ajoutées directement aux cultures de B. burgdorferi , puis mélangées au vortex pour former une suspension aqueuse, puis transférées immédiatement à des concentrations désirées avec des dilutions en série d'huile essentielle, puis ajoutées aux cultures de B. burgdorferi . La doxycycline (Dox), le céfuroxime (CefU), (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA) et la daptomycine (Dap) (AK Scientific, Union City, Californie, USA) ont été préparés à une concentration de 5 mg / mL dans des solvants appropriés [ 20 , 21 ], puis stérilisé sur filtre avec un filtre de 0,2 µm et conservé à -20 ° C sous forme de solutions mères.
2.3. Microscopie
Les suspensions de cellules de B. burgdorferi traitées ont été contrôlées avec un microscope à fluorescence tout-en-un BZ-X710 (KEYENCE, Itasca, IL, USA). La viabilité bactérienne a été évaluée par le test SYBR Green I / PI, qui a été réalisé en calculant le ratio de fluorescence verte / rouge après la mort pour déterminer le ratio de cellules vivantes et mortes, comme décrit précédemment [ 16 , 22 ]. La lecture de la viabilité cellulaire résiduelle a été obtenue en analysant trois images représentatives de la même suspension de cellules bactériennes prises par microscopie à fluorescence. Pour déterminer quantitativement la viabilité bactérienne à partir d'images de microscope, un logiciel d'analyse de BZ-X Analyzer et d'Image Pro-Plus a été utilisé pour évaluer l'intensité de la fluorescence, comme nous l'avons décrit précédemment [ 14 ].
2.4. Évaluation des huiles essentielles pour leurs activités contre les cultures en phase stationnaire de B. Burgdorferi
Pour évaluer l'activité possible des huiles essentielles sur la phase stationnaire de B. burgdorferi , des huiles essentielles solubles dans le DMSO à 10% ou une suspension aqueuse d'huiles essentielles insolubles dans le DMSO ont été ajoutées à 100 µL de la culture de B. burgdorferi en phase stationnaire âgée de sept jours . Plaque 96 puits pour obtenir les concentrations souhaitées. Dans le criblage primaire, chaque huile essentielle a été dosée avec des concentrations finales de 0,2% et 0,1% ( v / v ) dans des plaques à 96 puits. Des médicaments à base de daptomycine, de doxycycline et de céfuroxime ont été utilisés comme témoins à une concentration finale de 40 µM. Les impacts actifs ont été contrôlés avec des concentrations inférieures à 0,1% et 0,05%; tous les tests mentionnés ci-dessus ont été effectués en triple. Toutes les plaques ont été scellées et incubées à 33 ° C sans agitation pendant sept jours, et 5% de CO2 ont été maintenus dans l'incubateur.
2.5. Essais de sensibilité aux huiles essentielles et aux médicaments
Les cellules vivantes et mortes après un traitement de sept jours avec des huiles essentielles ou des antibiotiques ont été évaluées à l'aide du test SYBR Green I / PI associé à une microscopie à fluorescence, comme décrit [ 16 , 22 ]. En bref, le rapport entre les cellules vivantes et les cellules mortes était reflété par le rapport de la fluorescence vert / rouge, calculé à l'aide de l'équation de régression et de la courbe de régression avec l'analyse par ajustement par la méthode des moindres carrés.
Pour déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) du cinnamaldéhyde sur la croissance de B. burgdorferi , la méthode standard de microdilution a été utilisée et l’inhibition de la croissance a été évaluée par microscopie. Du stock de DMSO à 10% de cinnamaldéhyde a été ajouté aux cultures de B. burgdorferi (1 x 10 4 spirochètes / ml) pour obtenir une suspension initiale avec 0,5% de cinnamaldéhyde, puis une série de suspension a été préparée par des dilutions au double, les concentrations en cinnamaldéhyde étant de 0,5% (= 5 µg / mL) à 0,004% (= 0,04 µg / mL). Toutes les expériences ont été réalisées en triple. Les cultures de B. burgdorferi après traitement dans une microplaque à 96 puits ont été incubées à 33 ° C pendant sept jours. La prolifération cellulaire a été évaluée par le test SYBR Green I / PI associé au microscope à fluorescence BZ-X710 All-in-One.
2.6 Études de sous-culture visant à évaluer la viabilité d'organismes B. Burgdorferi traités à l'huile essentielle
Des huiles essentielles ou des médicaments témoins ont été ajoutés à 1 mL de culture en phase stationnaire de B. burgdorferi âgée de sept jours dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL, incubés pendant sept jours à 33 ° C sans agitation. Ensuite, les cellules ont été centrifugées et les culots cellulaires ont été lavés avec du milieu BSK-H frais (1 mL), puis remis en suspension dans 500 µL du même milieu sans antibiotiques. Ensuite, 50 µL de suspension cellulaire ont été inoculés dans 1 mL de milieu BSK-H frais, incubés à 33 ° C pendant 20 jours pour une sous-culture. La croissance cellulaire a été évaluée en utilisant le test SYBR Green I / PI et la microscopie à fluorescence, comme décrit ci-dessus.
3. Résultats
3.1. Évaluation de l'activité des huiles essentielles par rapport à la phase stationnaire B. Burgdorferi
Dans cette étude, nous avons exploré l'activité d'un autre groupe de 35 nouvelles huiles essentielles ainsi que des médicaments de contrôle contre une culture de phase stationnaire de B. burgdorferi âgée de sept jours dans des plaques à 96 puits incubées pendant sept jours. Notre précédente étude avait révélé que l'huile essentielle d'écorce de cannelle présentait une très forte activité contre la culture de B. burgdorferi en phase stationnaire, même à une concentration de 0,05% [ 18 ]. Pour identifier les composants actifs de l'huile essentielle d'écorce de cannelle, nous avons également ajouté du cinnamaldéhyde (CA), l'ingrédient principal de l'écorce de cannelle, dans cet écran. Le tableau 1 présente l'activité des 35 huiles essentielles et de l'AC contre la culture de B. burgdorferi en phase stationnaire. Bien que l'huile essentielle de Litsea cubeba ait montré une autofluorescence trop forte pour déterminer son activité à une concentration de 0,2%, toutes les autres huiles essentielles candidates, à l'exception des graines de persil, ont présenté une activité significativement plus forte ( p <0,05) que le témoin à la doxycycline ( tableau 1 ) à 0,2%. concentration avec le dosage SYBR Green I / PI. Parmi celles-ci, 16 huiles essentielles et de l'AC à 0,2% ont montré une forte activité contre la culture de B. burgdorferi en phase stationnaire par rapport aux antibiotiques témoins doxycycline, céfuroxime et daptomycine ( Tableau 1 ). Comme décrit précédemment [ 23 ], nous avons calculé le rapport entre les cellules vivantes résiduelles et les cellules mortes d'images de microscope en utilisant le logiciel Image Pro-Plus, ce qui pourrait éliminer l'autofluorescence du fond. En utilisant la microscopie à fluorescence, nous avons confirmé qu’à une concentration de 0,2%, les 16 huiles essentielles et l’AC pourraient éradiquer toutes les cellules vivantes en ne conservant que les cellules mortes et agrégées, comme indiqué dans le tableau 1 et la figure 1 . À une concentration de 0,1%, 10 huiles essentielles (ail, piment, cumin, palmarosa, myrrhe, hydacheim, amyris, thym blanc, Litsea cubeba , eucalyptus citronné) et de Californie présentaient une activité significative ( p <0,05) par rapport au courant utilisé en clinique la doxycycline ( tableau 1 ; figure 2 ). Parmi celles-ci, les huiles essentielles les plus actives étaient l'ail, le piment, le cumin, le palmarosa, la myrrhe et l'hydacheim en raison de leur activité remarquable même à 0,1%, comme le montrent les cellules totalement rouges (mortes) avec le test SYBR Green I / PI et le microscope à fluorescence. tests ( figure 1 ). Le CA a également montré une très forte activité à une concentration de 0,1%. Bien que les données du lecteur de plaques aient montré que les huiles essentielles de graine de carotte et de muscle profond avaient une activité significative ( p <0,05) par rapport au témoin de doxycycline, le résultat au microscope ne l’a pas confirmée en raison de la viabilité résiduelle élevée (60% et 68%, p > 0,05). ) ( Tableau 1 ). Pour les six autres huiles essentielles (menthe de maïs, fenouil doux, bois de sapin, bouleau, petit-grain et apaisement pour la tête), qui ont montré une forte activité à une concentration de 0,2%, nous n'avons pas trouvé qu'elles avaient une activité supérieure à celle du témoin de doxycycline à une concentration de 0,1%. ( Tableau 1 , Figure 2 ). En outre, bien que les huiles essentielles de bouleau et de Litsea cubeba aient une autofluorescence, ce qui a montré une fausse viabilité résiduelle élevée et interféré avec le test du lecteur de plaques SYBR Green I / PI, elles ont toutes deux présenté une forte activité contre la phase stationnaire B. burgdorferi, confirmée par SYBR. Microscopie à fluorescence Green I / PI.
Les 10 huiles essentielles et CA les plus importantes (viabilité résiduelle inférieure à 60%) ont été choisies pour évaluer leurs activités et explorer leur potentiel d’éradication des cultures de B. burgdorferi en phase stationnaire qui abritent un grand nombre de persiennes en utilisant des concentrations inférieures en huiles essentielles (0,1% et 0,05%). ). Nous avons effectué les tests de confirmation avec 1 ml de phase stationnaire B. burgdorferi dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml. À une concentration de 0,1%, les tests en tube ont confirmé les résultats actifs du criblage précédent sur plaque à 96 puits, bien que l'activité de toutes les huiles essentielles ait légèrement diminué lors des tests en tube par rapport aux tests sur plaque à 96 puits ( Tableau 2 , Figure 3 ). . À une très faible concentration de 0,05%, nous avons constaté que l'ail, le piment de la Jamaïque, le palmarosa et le CA présentaient une forte activité contre la phase stationnaire B. burgdorferi , approuvée par quelques cellules agrégées vertes résiduelles représentées dans le tableau 2 et la figure 3 . Parallèlement, nous avons également constaté que le CA présentait une forte activité contre B. burgdorferi en cours de réplication, avec une CMI de 0,02% (égale à 0,2 µg / mL).
3.2. Études de sous-culture visant à évaluer l'activité des huiles essentielles dans la phase stationnaire B. burgdorferi
Pour valider la capacité des huiles essentielles à éradiquer les cellules de B. burgdorferi en phase stationnaire, nous avons effectué des études de sous-culture en incubant les cellules traitées aux huiles essentielles dans du milieu BSK frais après élimination des médicaments avec lavage, comme décrit précédemment [ 14 ]. Nous avons sélectionné le top 10 des huiles essentielles actives (ail, piment de la Jamaïque, myrrhe, hydacheim, Litsea cubeba , palmarosa, eucalyptus citron, amyris, cumin et blanc de thym) afin de confirmer s'ils pourraient éradiquer les cellules de la phase stationnaire de B. burgdorferi à 0,1%. ou une concentration de 0,05% dans des expériences de sous-culture après l'exposition à l'huile essentielle ( tableau 2 ). À une concentration de 0,1%, nous n'avons trouvé aucune repousse dans les échantillons des cinq plus grands succès, y compris l'ail, le piment de la Jamaïque, la myrrhe, l'hydacheim et Litsea cubeba ( tableau 2 , figure 4 A). Cependant, palmarosa, eucalyptus citron, amyris, cumin et blanc de thym n'ont pas pu éradiquer les cellules de B. burgdorferi en phase stationnaire car de nombreux spirochètes étaient encore visibles après 21 jours de sous-culture ( figure 4A ). L'étude de sous-culture a également confirmé la forte activité de l'AC en ne montrant aucune croissance de spirochète après traitement avec 0,1% d'AC. À une concentration de 0,05%, nous n'avons pas observé de repousse en spirochète dans les échantillons traités avec de l'huile essentielle d'ail qui ont été sous-cultivés pendant 21 jours ( Figure 4 B), ce qui indique que l'huile essentielle d'ail pourrait complètement tuer toutes les formes de B. burgdorferi, même à une concentration de 0,05%. . Par contre, les quatre autres huiles essentielles actives (piment de la Jamaïque, myrrhe, hydacheim et Litsea cubeba ) à une concentration de 0,05% n'ont pas pu stériliser la culture de B. burgdorferi à la phase stationnaire, des spirochètes étant visibles après 21 jours de sous-culture ( Figure 4). B) Similaire au résultat précédent de sous-culture de l'huile essentielle d'écorce de cannelle [ 18 ], 0,05% de cinnamaldéhyde a stérilisé la culture en phase stationnaire de B. burgdorferi , comme le montre l'absence de repousse au bout de 21 jours de sous-culture ( figure 4 B), ce qui indique que le composant actif de l'écorce de cannelle est essentiel l'huile est attribuable au cinnamaldéhyde.
4. Discussion
Nous avons récemment découvert que de nombreuses huiles essentielles avaient une meilleure activité contre les cellules de B. burgdorferi en phase stationnaire que les antibiotiques actuellement utilisés en clinique pour traiter la maladie de Lyme [ 18 ]. Ici, nous avons examiné un autre panel de 35 nouvelles huiles essentielles utilisant la culture de B. burgdorferi en phase stationnaire comme modèle persistant [ 16 ]. Auparavant, nous avions constaté que 23 huiles essentielles avaient une forte activité à une concentration de 1%, mais seulement cinq d’entre elles présentaient une bonne activité à une concentration inférieure à 0,25% [ 18 ]. Pour identifier les huiles essentielles ayant une activité contre B. burgdorferi persistant à de faibles concentrations, nous avons effectué le dépistage aux concentrations de 0,2% et 0,1% dans cette étude. Certaines huiles essentielles, telles que l'huile Litsea cubeba , ont montré une autofluorescence élevée après la coloration du SYBR Green I / PI, ce qui a considérablement interféré avec le test SYBR Green I / PI ( Tableau 1 , Figure 1 ). Cependant, en utilisant une concentration plus faible (0,1%) et une microscopie à fluorescence, nous avons pu vérifier les résultats du test SYBR Green I / PI et éliminer le problème de l'autofluorescence avec certaines huiles essentielles. Une autre limite du dosage SYBR Green / IP réside dans le fait que toutes les cellules rougissant ne sont pas mortes et que des études supplémentaires de sous-culture sont nécessaires pour vérifier si les globules rouges marqués par PI sont réellement morts après l'exposition au médicament. Dans cette étude, nous avons identifié 18 huiles essentielles (à une concentration de 0,2%) plus actives que la daptomycine à 40 μM (un contrôle persistant du médicament qui pourrait éradiquer les cellules de la phase stationnaire de B. burgdorferi ), parmi lesquelles 10 huiles essentielles se distinguent par un effet remarquable. activité même à une concentration de 0,1% ( tableau 1 ). Parmi celles-ci, l'huile essentielle d'ail présentait la meilleure activité, comme en témoigne la plus faible viabilité résiduelle de B. burgdorferi à 0,1%. Dans les études comparatives ultérieures, l'huile essentielle d'ail a montré une activité stérilisante, même à une concentration inférieure à 0,05%, car aucune cellule de Borrelia ne s'est développée dans l'étude de sous-culture ( tableau 2 ). L'ail en tant qu'épice commune a été utilisé à travers l'histoire comme antimicrobien, et divers suppléments à l'ail ont été commercialisés sous forme de comprimés et de gélules. L'activité antibactérienne de l'ail a été décrite par des Chinois anciens et, plus récemment, par Louis Pasteur en 1858. Bien que l'allicine, un composé antibactérien de l'ail, ait une activité antibactérienne contre de multiples espèces bactériennes [ 24 , 25 ], elle a B. burgdorferi , en particulier l’organisme en phase stationnaire non en croissance, malgré son utilisation clinique anecdotique par certains patients atteints de la maladie de Lyme ( http://www.natural-homeremedies.com/blo ... -remedies- pour-maladie de lyme / ; http://lymebook.com/blog/supplements/ga ... c-allicin/ ). Dans cette étude, l'huile essentielle d'ail a été identifiée comme le candidat le plus puissant ayant une activité contre la phase stationnaire B. burgdorferi et son activité est équivalente à celle des huiles essentielles d'origan et d'écorce de cannelle, les deux huiles essentielles les plus actives contre B. burgdorferi que nous avons identifiées. dans notre étude précédente [ 18 ].
En outre, nous avons trouvé quatre autres huiles essentielles, à la myrrhe, à la myrrhe, à l’hydache et à Litsea cubeba qui ont démontré une excellente activité contre B. burgdorferi à la phase stationnaire, bien que les extraits ou les huiles essentielles de ces quatre plantes aient une activité antibactérienne sur d’autres bactéries. . L'allspice est un agent aromatisant couramment utilisé dans la transformation des aliments et il est connu pour ses activités antibactériennes sur de nombreux organismes [ 26 ]. La myrrhe en tant que médicament traditionnel est utilisée depuis l'Antiquité. De nos jours, la myrrhe est utilisée comme antiseptique dans les topiques et les dentifrices [ 27 ]. Il a été démontré que certains composants sesquiterpéniques de la myrrhe, notamment le furanodien-6-one, le méthoxyfuranoguai-9-én-8-one, ont une activité bactéricide et fongicide in vitro sur de multiples bactéries pathogènes, notamment E. coli , S. aureus , P aeruginosa et C. albicans [ 28 ], mais ces deux composés les plus actifs n'ont pas été détectés dans nos échantillons [ 19 ] ( tableau 3 ). L'huile essentielle d'Hydacheim est extraite de la fleur de Hedychium spicatum , connue sous le nom de lys au gingembre. L'extrait au méthanol de H. spicatum aurait une activité antimicrobienne contre de nombreuses bactéries, notamment Shigella boydii , E. coli , S. aureus , P. aeruginosa et K. pneumoniae [ 29 ]. Litsea cubeba est également utilisé depuis longtemps dans la médecine traditionnelle chinoise. Ses huiles essentielles de tiges, d'alabastrum, de feuilles, de fleurs, de racines et de fruits présentent également une activité antibactérienne sur B. subtilis , E. coli , E. faecalis , S. aureus , P. aeruginosa et M. albicans [ 30 ]. Sur la base de ces études et de l'application de piment de la Jamaïque, de la myrrhe, de l'hydacheim et de Litsea cubeba , il serait intéressant de développer des schémas thérapeutiques efficaces pour lutter contre la maladie de Lyme à l'avenir.
Bien que les huiles essentielles actives que nous avons identifiées aient une forte activité contre les cellules en phase stationnaire de B. burgdorferi in vitro, leur activité in vivo est inconnue à ce jour. Dans des études ultérieures, nous utiliserons la spectrométrie de masse GC pour identifier les ingrédients actifs des huiles essentielles actives et confirmer leur activité contre B. burgdorferi en croissance ou non. Une fois que nous avons identifié les composants actifs des huiles essentielles actives, des études d'association médicamenteuse peuvent être réalisées pour renforcer l'activité contre les bactéries persistantes. De plus, nous étudierons le mécanisme d'action des composés actifs dans un proche avenir. Le profil pharmacocinétique (PK) des composés actifs contenus dans ces huiles essentielles actives sera évalué et leur posologie et toxicité effectives seront déterminées in vivo. Dans notre précédente étude, nous avons constaté que l'huile essentielle d'écorce de cannelle présentait une excellente activité contre la phase stationnaire de B. burgdorferi [ 18 ]. Nous avons constaté ici que le CA est un composant actif de l'huile essentielle d'écorce de cannelle. L'AC pourrait éliminer la phase stationnaire de B. burgdorferi à une concentration de 0,05%, car aucune repousse ne se produirait en sous-culture ( tableau 2 ). Cela indique que les AC possèdent une activité similaire vis-à-vis de la phase stationnaire B. burgdorferi comme le carvacrol, qui est l'un des composés les plus actifs contre B. burgdorferi non en croissance que nous avons identifiés à partir de produits naturels [ 18 ]. De plus, on a observé que l'AC était très actif contre la croissance de cellules de B. burgdorferi avec une CMI de 0,2 µg / mL. L'activité antibactérienne de l'AC a également été rapportée sur certaines autres bactéries. Le mécanisme de l'activité antibactérienne de l'AC a été étudié sur différents microorganismes, ce qui suggère que son action antibactérienne repose principalement sur l'interaction avec la membrane cellulaire [ 31 ]. Le CA en tant qu'agent favorisant dans la transformation des aliments est également utilisé comme agent de conservation des aliments pour protéger les aliments pour animaux et les aliments destinés à l'homme des bactéries pathogènes [ 31 ]. L'AC est considérée comme un composé sans danger pour les mammifères, car la dose létale médiane DL 50 de l'AC est de 1850 ± 37 mg / kg par voie orale dans l'étude de toxicité aiguë avec le modèle de rat à administration par voie orale [ 32 ]. Ces résultats suggèrent que l'AC pourrait être un bon candidat médicament pour une évaluation plus poussée de B. burgdorferi dans des études futures. Nous souhaitons également souligner que la sécurité d'utilisation des huiles essentielles et de leurs composants nécessite des recherches plus approfondies; par exemple, la toxicité intraveineuse du carvacrol est considérablement plus élevée que la toxicité orale [ 33 ]. Ainsi, des études animales appropriées sont nécessaires pour confirmer l'innocuité et l'activité de l'AC et d'autres huiles essentielles actives dans des modèles animaux avant les études chez l'homme.
Cette étude a utilisé des cultures en phase stationnaire de B. burgdorferi enrichies en persists comme modèle persister pour les filtres à huiles essentielles. La raison pour laquelle nous avons utilisé ce modèle est que les études portant sur le pyrazinamide (PZA), un médicament persistant pour la tuberculose, qui est plus actif contre les cellules en phase stationnaire et persiste que contre les cellules en croissance logarithmique et qui raccourcit le traitement [ 34 , 35 ], suggèrent que les médicaments actifs contre les cellules stationnaires les cellules en phase / cellules persistantes seront plus efficaces pour traiter les infections persistantes que les médicaments actifs contre les cultures en croissance. Cela a été démontré dans le cas de la colistine en tant que médicament persistant pour E. coli utilisé conjointement avec de la quinolone ou du nitrofurane pourrait éradiquer plus efficacement une infection des voies urinaires chez la souris [ 36 ]. Des études ultérieures sont nécessaires pour déterminer si les huiles essentielles actives contre les cultures persistantes de B. burgdorferi en phase stationnaire non en croissance sont plus efficaces pour éradiquer les infections persistantes à B. burgdorferi chez les modèles animaux que les antibiotiques actuels de Lyme qui sont principalement actifs contre le développement de Borrelia .
5. Conclusions
En résumé, nous avons identifié quelques huiles essentielles supplémentaires ayant une forte activité contre les cellules de B. burgdorferi en phase stationnaire . Les huiles essentielles les plus actives comprennent l'ail, le piment de la Jamaïque, la myrrhe, l'hydacheim et le Litsea cube . Parmi eux, l'huile d'ail pourrait complètement éradiquer la phase stationnaire de B. burgdorferi sans repousse à 0,05% et les autres pourraient atteindre la même activité à 0,1%. De plus, le cinnamaldéhyde est un ingrédient actif de l'huile d'écorce de cannelle ayant une très forte activité contre les cellules de phase stationnaire de B. burgdorferi . De futures études seront menées pour identifier les composants actifs des huiles essentielles candidates et pour déterminer leur activité in vitro, seuls ou en association avec d'autres huiles essentielles actives ou antibiotiques, contre les souches de B. burgdorferi sensu lato, y compris B. burgdorferi, B. garinii et B. afzelii, et évaluent leur innocuité et leur efficacité contre B. burgdorferi sur des modèles animaux avant des essais sur l'homme.
Contributions d'auteur
Conceptualisation, YZ et JM; Méthodologie, JF, WS, GMT et CJM; Validation, JF, WS, GMT et CJM; Analyse formelle, JF et WS; Préparation de l'écriture et de l'original, JF et YZ; Rédaction et révision d'écriture, YZ, JM; Supervision, YZ; Acquisition de financement, YZ
Le financement
Cette recherche a été financée en partie par Global Lyme Alliance, la Fondation LivLyme, NatCapLyme et le Fonds de charité familial Einstein-Sim.
Remerciements
Nous reconnaissons le soutien de Global Lyme Alliance, de LivLyme Foundation, de NatCapLyme et du Fonds de charité familial Einstein-Sim.
Les conflits d'intérêts
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.
Références
CDC. Maladie de Lyme. Disponible en ligne: http://www.cdc.gov/lyme/ (consulté le 7 mars 2018).
Wormser, GP; Dattwyler, RJ; Shapiro, ED; Halperin, JJ; Steere, AC; Klempner, MS; Krause, PJ; Bakken, JS; Strle, F .; Stanek, G .; et al. Évaluation clinique, traitement et prévention de la maladie de Lyme, de l’anoplasmose granulocytaire humaine et de la babésiose: guides de pratique clinique de la société américaine des maladies infectieuses. Clin. Infecter. Dis. 2006 , 43 , 1089-1134. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Aucott, JN; Rebman, AW; Crowder, LA; Kortte, KB Symptomatologie du syndrome de Lyme post-traitement et impact sur le fonctionnement de la vie: y a-t-il quelque chose? Qual. Life Res. 2013 , 22 , 75. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Steere, AC; Gross, D .; Meyer, AL; Huber, BT Mécanismes auto-immuns dans l'arthrite de Lyme résistante aux antibiotiques. J. Autoimmun. 2001 , 16 , 263–268. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Bockenstedt, LK; Gonzalez, DG; Haberman, AM; Belperron, AA Les antigènes de spirochètes persistent près du cartilage après un traitement murin par la borréliose de Lyme. J. Clin. Enquête 2012 , 122 , 2652–2660. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Hodzic, E .; Imai, D .; Feng, S .; Barthold, SW Résurgence de Borrelia burgdorferi non cultivable persistant après un traitement antibiotique chez la souris. PLoS ONE 2014 , 9 , e86907. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Braises, ME Barthold, SW; Borda, JT; Bowers, L .; Doyle, L .; Hodzic, E .; Jacobs, MB; Hasenkampf, NR; Martin, DS; Narasimhan, S .; et al. Persistance de Borrelia burgdorferi chez les macaques rhésus après un traitement antibiotique d’une infection disséminée. PLoS ONE 2012 , 7 , e29914. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Hodzic, E .; Feng, S .; Holden, K .; Freet, KJ; Barthold, SW Persistance de Borrelia burgdorferi après un traitement antibiotique chez la souris. Antimicrob. Agents Chemother. 2008 , 52 , 1728-1736. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Marques, A .; Telford, SR, 3ème; Turk, SP; Chung, E .; Williams, C .; Dardick, K .; Krause, PJ; Brandeburg, C .; Crowder, CD; Carolan, HE; et al. Le xénodiagnostic pour détecter l'infection à Borrelia burgdorferi : une étude inédite sur l'homme. Clin. Infecter. Dis. 2014 , 58 , 937–945. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Straubinger, RK; Summers, BA; Chang, YF; Appel, MJ Persistance de Borrelia burgdorferi chez des chiens infectés de manière expérimentale après un traitement antibiotique. J. Clin. Microbiol. 1997 , 35 , 111-116. [ Google Scholar ] [ PubMed ]
Zhang, Y. Bacilles tuberculeux persistants et dormants et tuberculose latente. De face. Biosci. 2004 , 9 , 1136-1156. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Zhang, Y .; Si, WW; Barer, MR Le ciblage persiste pour le contrôle de la tuberculose. Antimicrob. Agents Chemother. 2012 , 56 , 2223–2230. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Sharma, B .; Brown, AV; Matluck, NE; Hu, LT; Lewis, K. Borrelia burgdorferi , l'agent responsable de la maladie de Lyme, forme des cellules persistantes tolérantes au médicament. Antimicrob. Agents Chemother. 2015 , 59 , 4616–4624. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Feng, J .; Auwaerter, PG; Zhang, Y. Combinaisons de médicaments contre Borrelia burgdorferi persiste in vitro: éradication obtenue en utilisant la daptomycine, la céfopérazone et la doxycycline. PLoS ONE 2015 , 10 , e0117207. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Caskey, JR; Embers, ME Développement persister par les populations de Borrelia burgdorferi in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 2015 , 59 , 6288–6295. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Feng, J .; Wang, T .; Shi, W .; Zhang, S .; Sullivan, D .; Auwaerter, PG; Zhang, Y. L'identification d'une nouvelle activité contre Borrelia burgdorferi persiste à l'aide d'une bibliothèque de médicaments approuvée par la FDA. Emerg. Microbes Infect. 2014 , 3 , e49. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Feng, J .; Zhang, S .; Shi, W .; Zhang, Y. La dose de pouls par ceftriaxone ne parvient pas à éradiquer la microcolonie de type biofilm, B. burgdorferi, qui est stérilisée par daptomycine / doxycycline / céfuroxime sans dosage de pouls. De face. Microbiol. 2016 , 7 , 1744. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Feng, J .; Zhang, S .; Shi, W .; Zubcevik, N .; Miklossy, J .; Zhang, Y. Selective Les huiles essentielles d'épices ou d'herbes culinaires ont une activité élevée contre la phase stationnaire et le biofilm Borrelia burgdorferi . De face. Med. 2017 , 4 , 169. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
TESTS GC / MS. Disponible en ligne: https://www.theplantguru.com/gc-ms-testing (consulté le 13 septembre 2018).
Wikler, MA; Comité national de laboratoire clinique. Normes de performance des tests de sensibilité aux antimicrobiens: Quinzième supplément d'information ; Institut de normalisation des cliniques et des laboratoires: Wayne, PA, États-Unis, 2005.
La convention de pharmacopée des États-Unis. The United States Pharmacopeia , 24ème édition; Convention sur la pharmacopée des États-Unis: Philadelphie, Pennsylvanie, États-Unis, 2000.
Feng, J .; Wang, T .; Zhang, S .; Shi, W .; Zhang, Y. Test SYBR Green I / PI optimisé pour une évaluation rapide de la viabilité et un test de sensibilité aux antibiotiques pour Borrelia burgdorferi . PLoS ONE 2014 , 9 , e111809. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Feng, J .; Shi, W .; Zhang, S .; Zhang, Y. Identification de nouveaux composés à forte activité contre la phase stationnaire Borrelia burgdorferi de la collection de composés NCI. Emerg. Microbes Infect. 2015 , 4 , e31. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Lawson, LD Garlic: Examen de ses effets médicinaux et des composés actifs indiqués. Dans Phytomedicines of Europe ; American Chemical Society: Washington, DC, États-Unis, 1998; pp. 176–209. [ Google Scholar ]
Petrovska, BB; Cekovska, S. Extraits de l'histoire et des propriétés médicales de l'ail. Pharmacogn. Rév. 2010 , 4 , 106-110. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Shelef, LA; Naglik, OA; Bogen, DW Sensibilité de certaines bactéries alimentaires courantes aux épices sauge, romarin et piment de la Jamaïque. J. Food Sci. 1980 , 45 , 1042-1044. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Lisa, EL; Carac, G .; Barbu, V .; Robu, S. L'effet antioxydant synergique et l'efficacité antimicrobienne de la propolis, de la myrrhe et de la chlorhexidine en tant que composants bénéfiques du dentifrice. Rev. Chim.-Buchar. 2017 , 68 , 2060-2065. [ Google Scholar ]
Dolara, P .; Corte, B .; Ghelardini, C .; Pugliese, AM; Cerbai, E .; Menichetti, S .; Lo Nostro, A. Propriétés anesthésiques locales, antibactériennes et antifongiques des sesquiterpènes de la myrrhe. Planta Med. 2000 , 66 , 356–358. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Ritu, A .; Avijit, M. Recherche phytochimique et activité antimicrobienne des rhizomes de Hedychium spicatum. Phcog. J. 2017 , 9 . [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
Wang, H .; Liu, Y. Composition chimique et activité antibactérienne des huiles essentielles de différentes parties de Litsea cubeba. Chem. Biodivers. 2010 , 7 , 229–235. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Friedman, M. Chimie, mécanismes antimicrobiens et activités antibiotiques du cinnamaldéhyde contre les bactéries pathogènes dans l’alimentation animale et l’alimentation humaine. J. Agric. Food Chem. 2017 , 65 , 10406-10423. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Subash Babu, P .; Prabuseenivasan, S .; Ignacimuthu, S. Cinnamaldéhyde - Un agent antidiabétique potentiel. Phytomedicine 2007 , 14 , 15-22. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Feketa, VV; Marrelli, SP Administration systémique de l'agoniste du canal ionique TRPV3, Carvacrol, induit l'hypothermie chez des rongeurs conscients. PLoS ONE 2015 , 10 , e0141994. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Zhang, Y .; Shi, W .; Zhang, W .; Mitchison, D. Mécanismes d'action et de résistance à la pyrazinamide. Microbiol. Spectr. 2013 , 2 , 1–12. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Zhang, Y .; Permar, S .; Soleil, Z. Conditions pouvant influer sur les résultats des tests de sensibilité à Mycobacterium tuberculosis au pyrazinamide. J. Med. Microbiol. 2002 , 51 , 42–49. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Cui, P .; Niu, H .; Shi, W .; Zhang, S .; Zhang, H .; Margolick, J .; Zhang, W .; Zhang, Y. Une perturbation de la membrane par la colistine tue les souches uropathogènes d' Escherichia coli et améliore la destruction d'autres antibiotiques. Antimicrob. Agents Chemother. 2016 , 60 , 6867–6871. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
Antibiotiques 07 00089 g001 550
Figure 1. Effet de 0,2% d'huiles essentielles sur la viabilité de la phase stationnaire de B. burgdorferi. Une culture en phase stationnaire de B. burgdorferi âgée de 7 jours a été traitée avec une huile essentielle à 0,2% ( v / v ) pendant sept jours, suivie d'une coloration avec le test de viabilité SYBR Green I / PI et une microscopie à fluorescence.
Antibiotiques 07 00089 g002 550
Figure 2. Effet de 0,1% d'huiles essentielles sur la viabilité de la phase stationnaire de B. burgdorferi. Une culture en phase stationnaire de B. burgdorferi âgée de sept jours a été traitée avec une huile essentielle à 0,1% ( v / v ) pendant sept jours, suivie d'une coloration avec le test de viabilité SYBR Green I / PI et une microscopie à fluorescence.
Antibiotiques 07 00089 g003 550
Figure 3. Effet des huiles essentielles actives sur la phase stationnaire de B. burgdorferi . Une culture en phase stationnaire de 1 mL de B. burgdorferi (âgée de sept jours) a été traitée avec des huiles essentielles à 0,1% ( A ) ou 0,05% ( B ) (marquées sur l'image) dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL pendant 7 jours, suivie d'une coloration au SYBR. Test de viabilité Green I / PI et microscopie à fluorescence.
Antibiotiques 07 00089 g004 550
Figure 4. Sous-culture de B. burgdorferi après traitement aux huiles essentielles. Une culture en phase stationnaire de B. burgdorferi (âgée de sept jours) a été traitée avec les huiles essentielles indiquées à 0,1% ( A ) ou 0,05% ( B ) pendant sept jours, puis lavée et remise en suspension dans du milieu BSK-H frais et sous-culture pendant 21 jours. journées. La viabilité de la sous-culture a été examinée par microscopie à fluorescence et à coloration SY I Green I / PI.
Table
Tableau 1. Effet des huiles essentielles sur une phase stationnaire âgée de sept jours B. burgdorferi a .
Table
Tableau 2. Comparaison des 10 principales activités des huiles essentielles par rapport à la phase stationnaire B. burgdorferi avec traitement et sous-culture à 0,1% et 0,05% ( v / v ) a .
Table
Tableau 3. Les cinq principales compositions des trois huiles essentielles les plus actives.
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